Análise Microbiológica da Água
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ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAL PARA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA

2005


ABORDAGEM:

"Esterilização de material para análise microbiológica"


INTRODUÇÃO

Esterilizar um material é destruir todos os microorganismos nele existentes. A esterilização só pode ser efetuada de modo seguro e eficiente pelo emprego de agente físico (calor) ou químico.

Neste ensaio, utilizaremos a esterilização que é comumente efetuada, que é a esterilização pelo calor úmido através da autoclave.


OBJETIVO

Preparar kits de vidrarias para análise microbiológica isentos de microorganismos, bem como manipular com segurança uma autoclave para esterilização de material.


EXPERIMENTAL

MATERIAL UTILIZADO

Vidrarias

  • Pipeta graduada 1,0 mL - 04 unid.
  • Pipeta graduada 5,0 mL - 04 unid.
  • Pipeta graduada 10,0 mL - 04 unid.
  • Placas de petri - 06 unid.
  • Frascos para coleta 200 mL - 06 unid.
  • Proveta 100,0 mL - 04 unid.
  • Erlenmeyer 250 mL - 02 unid.
  • Tubo de ensaio com tampa - 01 unid.
  • Barbante - 08 unid.
  • Papel madeira
  • Papel de seda
  • Algodão
  • Tesoura


Equipamentos

Autoclave


PROCEDIMENTO OPERACIONAL

O procedimento operacional foi realizado segundo o POP n0 01, anexo a este relatório.


RESULTADOS E DISCUSSÕES

Todo o material esterilizado foi acondicionado em local seco e disponível para uso em análise microbiológica da água. A embalagem só deve ser retirada quando for necessária para uso, em ambiente estéril, como a capela de fluxo laminar.

A esterilização pelo calor úmido é mais usado em laboratórios pequenos e tem um poder de penetração superior ao do calor seco e constitui por isso um agente esterilizante mais eficaz. A razão na eficiência do calor úmido reside no fato que na termocoagulação das proteínas catalisada pela água contida nos microorganismos.

Uma parte importante durante a esterilização que deve ser verificada é a eliminação do ar residual, de modo a utilizar apenas o vapor d’água superaquecido. Uma mistura de ar mais vapor não atinge na autoclave, sob a mesma pressão, temperatura tão elevada quanto o vapor só e ainda por cima não tem, por conseqüência, tão grande eficiência esterilizante.

Outro aspecto que vale ser ressaltado é a limpeza da autoclave, onde a água deve ser totalmente retirada e o seu interior lavado com água e sabão, deixando agir por algunsminutos hipoclorito de sódio para evitar a proliferação de microorganismos, ocasionada por resíduos de meios de cultura.


REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] PINTO, T. J. A. KANEKO, T. M. & OHARA, M. T. Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. São Paulo: Atheneu editora, 2000.

[2] Transparências do Curso Técnico em Química – Microbiologia I. Centro Federal de Educação Tecnológica do Amazonas. Profa Sônia Lima. 2002.

[3] SIQUEIRA, R. S. Manual de Microbiologia de Alimentos. Brasília: EMBRAPA, 1995.

[4] Apostila de técnicas de laboratório em microbiologia. Curso Técnico de Química Industrial. CEFET-AM:Manaus, 2002.

[5] TRABULSI, L. R. Microbiologia. 3ed. São Paulo: Atheneu Editora, 2002.

[6] Técnicas de Segurança em Laboratório – Microbiologia I. Centro Federal de Educação Tecnológica do Amazonas. Profa Sônia Lima. 2002.

[7] PELZCAR JR., M. J. , CHAN, E. C. S. & KRIEG, N. R. Microbiologia: conceitos e aplicações. 2ed. São Paulo: Makron Books, 1996. 1v.


ANEXO

Procedimento Operacional Padrão n0.01 para "ESTERILIZAÇÃO DE MATERIAL PARA ANÁLISE MICROBIOLÓGICA"


ABORDAGEM:

"Análise de água método PCA Pour Plate: bactérias heterotróficas"


INTRODUÇÃO

A água merece especial consideração pelo seu amplo uso e características propícias ao crescimento microbiano. Quando considerada como componente de formulações, é por vezes preponderante, e justamente por isso tais produtos são mais propensos ao desenvolvimento microbiano. A água é também empregada nos diferentes tipos de limpeza, operações unitárias intermediárias, entre outros usos. Recebe tratamento e critério de análise distintos conforme a aplicação que se tem em vista.

A característica de potabilidade da água esta na dependência da legislação de cada país, já que esta define critérios e limites aceitáveis. Ainda assim, sob o ponto de vista microbiológico pode-se afirmar que a potabilidade está associada a ausência de patogênicos, por sua vez, a patogenicidade está ligada a contaminação fecal.

Considerando a dificuldade em pesquisar os patogênicos de maneira direta, freqüente a sua sensibilidade quando em quantidade reduzidas, aos processos onerosos e prolongadas, além da necessidade de laboratórios muito bem equipados, lança-se mão da pesquisa do indicador de contaminação fecal. Considera-se que águas que apresentam contaminação fecal são potencialmente perigosas.

Os indicadores de contaminação fecal são microrganismos presentes nas fezes em quantidade muito acima dos patogênicos. As características ideais de um indicador de contaminação fecal são: presença simultânea a dos microrganismos patogênicos; tempo de sobrevivência igual ou superior aos patogênicos; resistência equivalente a dos patogênicos aos processos de autodepuração; o seu número deve ser multiplicar no ambiente livre; por último.

Praticidade no método de detecção.

Neste relatório, serão descritos os procedimentos realizados para análise microbiológica de uma amostra de água de poço, através do método de inoculação profunda "pour plate" e indicação por bactérias heterotróficas. Foi utilizado também um controle positivo, preparado pela professora Sônia Lima, para comparação com os resultados, caso fossem estes negativos aos indicadores (sem crescimento bacteriano).


OBJETIVO

Analisar bacteriologicamente uma amostra de água através do método de semeadura "pour plate" com o indicador sendo bactérias heterotróficas.


EXPERIMENTAL

MATERIAL UTILIZADO

Vidrarias

Reagentes

01 pêra de borracha Água destilada

02 Erlenmeyers 250 mL Água peptonada

02 frascos com tampa PCA (Ágar padrão para contagem)

06 placas de petri estéreis Amostra de água

03 pipetas graduadas 1,0 mL

Pipeta graduada 10,0 mL

Espátula

02 frascos 200 mL com tampa

Proveta 100 mL

Vidro de relógio

Estante para tubos de ensaio

Equipamentos

  • Capela esterilizada fluxo laminar
  • Balança analítica
  • Contador de colônias


PROCEDIMENTO OPERACIONAL

Antes de qualquer procedimento, ligou-se a lâmpada UV para esterilização da capela de fluxo laminar por 30 minutos. O meio PCA, antes autoclavado e conservado em geladeira, foi mantido a uma temperatura de 450C até o momento da inoculação.

A) Preparo do meio de cultura PCA (Agar padrão para contagem):

Com a proporção do meio 22,5g de PCA para 1L de solução, pesaram-se 1,125g de PCA e diluiram-se em 50 mL de água destilada num erlenmeyer. Autoclavam-se a 121°C, 1 bar por 15 minutos, mantendo-se posteriormente num banho-maria a 40°C para não solidificar até o momento da incubação.

B) Preparo da água peptonada:

Com a proporção do meio 20 g de água peptonada para 1L de solução, pesaram-se 3,8 g de água peptonada e diluiu-se em 190 mL de água destilada num erlenmeyer. Dividem-se estes 190 mL nos dois frascos com tampa (90 mL em cada frasco). Autoclavam-se a 121°C, 1 bar por 15 minutos para esterilização.

C) Preparo da amostra: num ambiente estéril

Retirar 10 mL da amostra de água e adicionar a um dos frascos com 90 mL de água peptonada (diluição 1:10);

Deste frasco (1:10), retirar 10 mL e adicionar a um dos frascos com 90 mL de água peptonada (diluição 1:100);

Identificar todos os frascos das diluições.

D) Incubação "pour plate" da amostra:

Num ambiente estéril, com uma pipeta estéril, adicionou-se em uma placa de petri entreaberta 1 mL da diluição 1:10 em cada placa. Repetiu-se o processo para as diluições 1:100.

Adicionou-se em cada placa cerca de 18 mL do meio PCA.

Homogenizou-se meio e amostra movimentando-se em 8 na bancada as placas fechadas, cuidadosamente.

Aguardou-se a solidificação das placas com a amostra em temperatura ambiente.

Identificaram-se as placas.

Após a solidificação, isolaram-se as placas de forma invertida em uma estufa a uma temperatura adequada de 350C por 07 dias.

No final do período de incubação, fazer a contagem das colônias com o auxílio de um contador de colônias e anotar os resultados.


RESULTADOS E DISCUSSÕES

Em nossa aula prática, obtivemos os seguintes resultados:

Diluição Densidade (UFC / mL)

Amostra de água 1:10 28

Amostra de água 1:100 01

Controle positivo 1:10 9240

Controle positivo 1:100 58800

Para determinação da densidade de bactérias heterotróficas aeróbias e anaeróbias facultativas, a amostras foi semeada em meio PCA ("Plate Count Agar"), a 35 ± 0,5°C durante 07 dias. A densidade de bactérias heterotróficas é obtida multiplicando-se a média das contagens das colônias por placa pela diluição utilizada. O resultado é expresso como unidades formadoras de colônias de bactérias por ml.

O Ministério da Saúde determina que para avaliar as condições sanitárias dos sistemas de abastecimento público de água, é recomendada a contagem de bactérias heterotróficas, que não poderão exceder a 300 ufc/ml. A contagem de bactérias heterotróficas em placas fornece um número aproximado de bactérias aeróbias e anaeróbias facultativas, capazes de se multiplicar a 35ºC, verificando a qualidade bacteriológica da água.


REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] PINTO, T. J. A. KANEKO, T. M. & OHARA, M. T. Controle biológico de qualidade de produtos farmacêuticos, correlatos e cosméticos. São Paulo: Atheneu editora, 2000.

[2] Transparências do Curso Técnico em Química – Microbiologia I. Centro Federal de Educação Tecnológica do Amazonas. Profa Sônia Lima. 2002.

[3] SIQUEIRA, R. S. Manual de Microbiologia de Alimentos. Brasília: EMBRAPA, 1995.

[4] Apostila de técnicas de laboratório em microbiologia. Curso Técnico de Química Industrial. CEFET-AM:Manaus, 2002.

[5] TRABULSI, L. R. Microbiologia. 3ed. São Paulo: Atheneu Editora, 2002.

[6] Técnicas de Segurança em Laboratório – Microbiologia I. Centro Federal de Educação Tecnológica do Amazonas. Profa Sônia Lima. 2002.

[7] PELZCAR JR., M. J. , CHAN, E. C. S. & KRIEG, N. R. Microbiologia: conceitos e aplicações.2ed. São Paulo: Makron Books, 1996. 1v.

[8] PORTARIA Nº 518/GM Em 25 de março de 2004